LANGKAH-LANGKAH
PEMBUATAN PREPARAT AWETAN HISTOLOGI
Makalah
ini disusun untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Histologi dengan dosen
pengampu Bapak Lufti Harisusanto S,Pd
 |
Disusun Oleh :
Ardina Nasution
Dasep Ihwanudin
Mumun Munawaroh
Sherli Herlinawati
Semester VI/D
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS PAKUAN
2013
BAB I
PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Jaringan dalam bahasa Perancis adalah
"tissue" yang pertama kali digunakan oleh Bichat seorang ahli anatomi
dan fisiologi dari Perancis yang terkesan oleh ragam anyaman yang dijumpainya
sewaktu mendeteksi tubuh. Observasi mikroskop pada jaringan yang berbeda
memastikan bahwa satuan terkecil dari jaringan dibentuk oleh sel, sel inilah
merupakan struktur terkecil yang membentuk tubuh manusia,hewan dan tumbuhan
(Lianury, 2000).
Tubuh tumbuhan secara morfologi terdiri
atas unit sel yang dilindungi oleh dinding, dan masing-masing sel dengan mengadakan
kesatuan dengan adanya substansi antar sel. Di dalam tubuh tumbuhan sel-sel ini
terdapat dalam kelompok yang secara struktural dan fungsional berbeda dengan
kelompok sel yang lain. Kelompok-kelompok sel-sel tersebut dikenal dengan
jaringan
Preparat awetan jaringan tumbuhan adalah
salah satu media pembelajaran Biologi yang sangat efektif. Dengan latar
belakang seperti di atas, maka diharapkan kita dapat mengamati dan melihat
preparat dengan menggunakan metode paraffin dengan pewarnaan tunggal
Sel tumbuhan mempunyai bentuk, ukuran
dan struktur yang bervariasi. Struktur sel rumit, namun demikian semua sel
mempunyai persamaan dalam beberapa segi dasar. Jaringan yang menyusun
tumbuh-tumbuhan terdiri dari jaringan muda dan dewasa. Jaringan-jaringan ini
dapat ditemukan pada bagian akar, batang dan daun tumbuhan. Jaringan ini dapat
dilihat dengan membuat suatu preparat penampang dari bagian-bagian.
Berdasarkan teori diatas maka
dilakukanlah percobaan tentang pembuatan preparat dengan metode parafin
I.2 Tujuan
Tujuan dari percobaan ini yaitu
untuk mengetahui cara pembutan preparat awetan histologi dengan menggunakan
metode parafin.
BAB
II
PEMBAHASAN
2.1
Pengertian
Metode Parafin
Banyak
cara dalam pembuatan preparat jaringan tumbuhan, diantaranya adalah dengan
metode parafin. Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam
jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metoda ini.
Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis
dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku,
tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal
irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri
dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh
lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga
memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah.
Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode
ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan metode ini.
Metode
parafin merupakan cara pembuatan preparat permanen yang menggunakan parafin
sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 mikron-8
mikron. Metode ini memiliki irisan yang lebih tipis daripada menggunakan metode
beku atau metode seloidin yang tebal irisannya kurang lebih mencapai 10 mikron.
Metode
parafin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua
jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari
suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat
diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode
paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah metode yang paling
umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent, baik pada tumbuhan ataupun
pada hewan.
2.2 Langkah-Langkah Dalam Pembuatan
Preparat Histologi
A. Fiksasi
Tujuan
fiksasi adalah untuk mematikan dengan cepat spesimen yang berupa jaringan dan
sel-sel juga utuk mempertahankan struktur sel dan jaringan sebagaimana aslinya.
Udara dalam jaringan spesimen harus dikeluarkan terlebih dahulu kemudian
diganti dengan larutan fiksatif
Larutan
fiksasi yang digunakan untuk proses fiksasi adalah larutan Bouine. Larutan
fiksasi ini merupakan larutan yang mampu bereaksi dan menandai suatu sel dengan
spesimen diiris setipis mungkin. Hal ini mendukung laju fiksasi dalam sel.
Proses
pertama yang disiapkan dalam menyiapkan materi segar dalam pengamatan
mikroskopis yaitu fiksasi. Tujuan dilakukannya fiksasi adalah mencegah
kerusakan jaringan, menghentikan proses metabolisme secar cepat, mengawetkan
komponen sitologis dan histologis, mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan
materi yang lembek, dan jaringan-jaringan dapat diwarnai sehingga bisa diketahui
bagian-bagian jaringan.
Faktor-faktor yang berperan dalam fiksasi
·
Buffer (pH),
·
Suhu yang rendah mencegah
autolisis,untuk mendapatkan daya penetrasi yang tinggi digunakan irisan setipis
mungkin,
·
Perubahan volume,
·
Osmolaliitas pada larutan fiksatif,
·
Penambahan deterjen sehingga fiksatif
cepat masuk,
·
Konsentrasi, dan waktu fiksatif.
1.
Dehidrasi
Dehidrasi
yaitu tahap pengeluaran air dari jaringan dengan perendaman alkohol secara
bertingkat dan dalam jangka waktu tertentu. Kemudian pengambilan alkohol
dilakukan dengan perendaman dalam xylol secara bertahap dengan jangka waktu
tertentu. Proses penggantian larutan penjernih dengan merendam spesimen dalam parafin.
Penggantian xylol dalam jaringan oleh parafin berlangsung secara
berangsur-angsur. Proses penggantian ini berlangsung di dalam oven sehingga
xylol tidak menguap dan parafin tidak membeku. Temperatur oven lebih tinggi
sedikit di atas titik cair paraffin.
Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air
dalam jaringan. Bahan yang digunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan
fungsi air. Dehidrasi yang baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari
konsentrasi 70% sesuai dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke
dalam alkohol 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi
dilakukan pengulangan 3 kali.
2.
Penjernihan
Penjernihan
dengann xilol dan dilanjutkan dengan alkohol : xilol dengan perbandingan 3:1,
1:1, 1:3 masing-masing selama 3 menit. Kemudian didehidrasi lagi dengan alkohol
alkohol secara bertingkat dan dilanjutkan pencucian dengan aquades. Hal ini
disebut dengan rehidrasi. Rehidrasi ini dilakukan untuk mempersiapakan keadaan
spesimen untuk proses pewarnaan yang mengandung air.
3.
Infiltrasi
Tahap
berikutnya yaitu infiltrasi, jaringan dimasukkan ke dalam filtran, yaitu
parafin dan xilol dengan perbandingan 9:1 selama 24 jam.
4.
Embedding
Merupakan
proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini
memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom.
Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa membuat
arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di
ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam
kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan
parafin sampai membeku.
Pengeblokan
ini mengguna-kan kotak atau takir yang dibuat dari kertas kalender. Pada saat
pengeblokan spesimen diletakkan sesuai posisi yang diinginkan. Setelah itu
parafin didinginkan dengan segera. Setelah dingin maka dilakukan pengirisan,
pengirisan digunakan alat mikrotom biasanya dengan ukuran 10 mikron sampai 14
mikron. Irisan akan berbentuk seperti pita-pita. Pemindahan irisan menggunakan
kuas kecil yang telah dibasahi ujungnya dengan air.
5.
Proses
penyayatan (sectioning)
Penyayatan diawali dengan pengirisan blok parafin dengan
scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom
berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang
diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita
hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca
obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin
memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang
sangat baik. Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan
merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan
hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.
Irisan
utuh suatu specimen sangat bermanfaat bagi sudi pembelajaran. Dengan adanya
preparat utuh maka dapat diamati bagian-bagian jaringan dan jenis sel yang ada
dalam satu preparat. Dalam pembuatan preparat utuh diupayakan permanen atau
awet agar sewaktu-waktu dapat diamati kembali. Dalam pembuatan preparat
hendaknya dipahami karakteristik tanaman yang akan diambil sebagai spesimen.
Karakteristik tersebut dapat berdasarkan atas pengelompokan jenis batang,
termasuk dalam herba atau berkayu kemudian dilanjutkan berdasarkan penentuan
tumbuhan tersebut tergolong dalam angiospermae atau gymnospermae dan
selanjutnya tumbuhan itu tergolong dalam tumbuhan dikotil atau monokotil.
Perbedaan karakteristik tumbuhan yang akan diambil sebagai spesimen menentukan
larutan fiksatif dan zat warna yang akan digunkan dalam pembuatan preparat.
Karakteristik
tumbuhan yang akan diambil spesimennya juga menentukan waktu pada tahap-tahap
pemrosesan. Misalnya waktu yang berlebih pada suatu tahap pengecatan akan
mengakibatkan suatu warna menjadi terlalu gelap dan mungkin warna lainnya
menjadi kurang atau bahkan hilang. Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini
tergantung pada lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan,
perembesan dan pengeblokan parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang
dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat warna yang akan digunakan
menentukan keberhasilan preparat irisan.
*Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen
biologi menjadi bagian yang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa
mikrotom menggunakan pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan
jaringan hewan atau tumbuhan dalam histologi
6.
Penempelan
Penempelan
menggunakan perekat haupt kemudian disimpan dalam kotak pengering. Selanjutnya
akan dilakukan pewarnaan dan mounting. Dalam proses pewarnaan dilakukan dalam
jangka waktu tertentu, jika terlalu lama atau terlalu singkat dapat menyebabkan
warna preparat menjadi kurang atau bahkan terlalu gelap. Selanjutnya dilakukan
mounting dengan ditetesi balsam kanada sehingga irisan akan tetap awet dengan
struktur sel serta jaringan.
Proses
penempelan spesimen ke kaca benda tidak benar-benar melekat sehingga saat
pewarnaan spesimen ada yang lepas. Agar spesimen dapat menempel sempurna pada
kaca benda dibutu
hkan tenggat waktu yang cepat antara
peletakkan spesimen pada kaca benda yang telah diberi pelekat Haupt. Setelah
benar-benar melekat di kaca benda maka irisan yang berada di kaca benda
dipanaskan di atas lampu spiritus untuk lebih memaksimalkan perlekatannya.
7.
Pewarnaan
Dalam
proses pewarnaan dilakukan dalam jangka waktu tertentu, jika terlalu lama atau
terlalu singkat dapat menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau bahkan
terlalu gelap. Selanjutnya dilakukan mounting dengan ditetesi balsam kanada
sehingga irisan akan tetap awet dengan struktur sel serta jaringan. Zat warna
yang digunakan tidak hanya satu macam karena tidak semua sel dapat menyerap
satu macam zat warna. Pada saat pewarnaan preparat akar inisel dalam jaringan
tidak terwarnai. Hal ini dapat disebabkan oleh waktu yang digunakan untuk
pemberian warnanya terlalu singkat sehingga zat warna belum terserap sempurna
oleh jaringan.
Pewarna
yang diberikan pada irisan dalam jangka waktu tertentu, kurang atau lebih waktu
yang digunakan menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau terlalu gelap.
Sedangkan hasil preparat yang tidak utuh dapat disebabkan oleh suhu sekitar
ruangan yang kurang mendukung saat dilakukan pengirisan selain itu masih
tersisanya air atau alkohol dalam jaringan juga dapat menyulitkan dalam pengirisan.
DAFTAR PUSTAKA
Amanda, 2007, Membuat Preparat Melintang
Dengan Metode Parafin, http://monocotil.blogspot.com, Diakses pada tanggal 20
September 2011.
Botanika, 2008, Fixation, Embedding,
Sectioning, http://botanika.biologija.org, Diakses pada tanggal 20 September
2011.
Lianury,
Robby N, 2000, Histologi, Universitas Hasanuddin Press, Makassar.
Praptomo, 2010, Pembuatan Preparat
Parafin Jaringan Tumbuhan (Mikroteknik), http://www.nagkoyo.com, Diakses pada
tanggal 20 September 2011.
Rina, 2011, Mikroteknik,
http://rinaningtyas.blogspot.com, Diakses pada tanggal 20 September 2011.
Setjo,
Susetyoadi, 2004, Anatomi Tumbuhan, Universitas Negeri Malang, Malang.
Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001,
Mikroteknik Tumbuhan, Universitas Negeri Malang, Malang.
Wikipedia, 2011, Mikrotom,
http://www.wikipedia.com, Diakses pada tanggal 20 September 2011.
